伊拉斯谟精通希腊语和拉丁语，因此他可以将《希腊语经卷》（俗称“新约”）的早期手抄本，与《通俗拉丁文本圣经》等几个拉丁语译本作对比。他越来越意识到圣经的知识对人极为重要，所以他坚信圣经应该被翻译成当日各国通用的语言。

伊拉斯谟相信基督教信仰应该是一种生活方式，而不该只是墨守毫无意义的宗教仪式而已，因此他积极推动天主教会的内部革新。后来，一些改革家开始抗议并要求罗马天主教会进行改革。那时，伊拉斯谟由于自己之前的立场而遭到天主教会的猜忌。

伊拉斯谟在自己的著作里，以讽刺的口吻揭露教士阶层堕落的行为和奢华无度的生活方式，他甚至指责教皇支持战争、野心勃勃。伊拉斯谟与当日腐败的教士截然不同，那些教士利用教会的传统——如圣人崇拜、忏悔认罪、朝拜、禁食——来剥削信徒。对教会的一些做法，如出售赎罪券、禁止神职人员结婚，伊拉斯谟也不认同。

1516年，伊拉斯谟编订的希腊语《新约》圣经第一版问世了。这是首部印刷的《新约》希腊语文本，书中还包括他翻译的拉丁语《新约》和所作的注解。不过，伊拉斯谟的翻译和当时最权威的《通俗拉丁文本圣经》已有所区别。后来，伊拉斯谟继续修订自己的译本，最终二者的区别就更大了。

其中一个区别是约翰一书5:7。为了支持三位一体的教义，《通俗拉丁文本圣经》在此加插了原文没有的话，这节“杜撰的经文”说：“在天上有父，有道，有圣灵，这三位是合一的。”但伊拉斯谟发现，没有任何早期希腊语手抄本包含这句话。因此，他在编订希腊语《新约》的头两版时，都没有收录这节“杜撰的经文”，后来迫于教会的压力，他才在第三版中添加了这句话。

伊拉斯谟编订的希腊语《新约》圣经，为欧洲其他语言的圣经翻译奠定了基础。德国的马丁·路德、英国的廷德尔、意大利的布鲁乔奥利和西班牙的恩西纳斯，都根据伊拉斯谟的希腊语文本，将《新约》翻译成各自的母语。

伊拉斯谟生活的时代正值欧洲宗教界风起云涌之时，他编订的希腊语《新约》圣经被宗教改革家视为无价之宝。在很长一段时间里，他都被视为宗教改革家。不过，后来天主教会和宗教改革家进行激烈的神学辩论时，伊拉斯谟却拒绝支持任何一方。因此，学者戴维·沙夫曾这样评价伊拉斯谟：“他去世时无门无派、遗世独立；天主教不愿承认他，而基督新教也无法接纳他。”